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          磁性活化細胞分選法(MACS)

          發(fā)布時間: 2021-11-15  點擊次數(shù): 1489次

          材料與儀器

          緩沖液
          磁性細胞分離器 分離柱適配器 陽性選擇柱 符合收集容積的收集器 磁性微珠

          步驟

          一、標(biāo)記

          1. 標(biāo)準(zhǔn)方法分離外周血單核細胞或經(jīng)酶消化法及其他方法制備的細胞懸液。

          2. 用 Ficoll-Paque 去除死細胞。

          3. 用 30 μm 尼龍網(wǎng)篩或濾膜(Myltenyi,# 414: 07)過濾細胞去除細胞團塊 (濾膜應(yīng)用前用緩沖液濕潤)。

          4. 緩沖液(D-PBS,pH 7.2 ,含 0.5 % BSA 和 2 mmol/L EDTA)洗滌細胞,離心。

          5. 重新懸浮離心細胞,每 107 個細胞懸浮于 80 μl 緩沖液(80 μl 為最少*,即使總細胞數(shù)低于 107 個)。

          6. 按每 107 個細胞加微珠標(biāo)記液 20 μl。

          7. 混勻,6~12℃ 孵育 15 min (對于更少的細胞,用同樣體積的微珠標(biāo)記液)。

          8. 加入 10~20 倍于標(biāo)記液體積的緩沖液稀釋細胞。

          9. 300 g 離心 10 min。

          10. 去上清,按每 108 個細胞加緩沖液 500 μl 重新懸浮結(jié)合了微珠的細胞。

          二、陽性磁性分離

          11. 將分離柱放入 MACS 分離器(MiniMACS、MidiMACS、VarioMMMACS,或 SuperMACS(Miltenyi))的磁性區(qū)。

          12. 洗柱:MS/ RS 500 μl; LS/ VS 3 ml。

          13. 將細胞懸液加人分離柱中:MS/ RS 500~1000 μl; LS/ VS 1~10 ml。

          14. 讓陰性細胞流過分離柱。

          15. 用緩沖液淋洗柱子: MS/ RS 3×500 μl; LS/ VS 3×3 ml。

          16. 將分離柱從分離器中取出放置在收集管上。

          17. 用吸管加適量緩沖液于柱中(MS/ RS 1 ml; LS/ VS 5 ml),推動針管式活塞洗脫陽性標(biāo)記細胞。

          18. 細胞計數(shù),用生長培養(yǎng)基調(diào)整濃度。

          (a)原代培養(yǎng)調(diào)整為1×105~1×106 /ml,接種于培養(yǎng)瓶中;

          (b)克隆培養(yǎng)調(diào)整為 10~1000 /ml,接種于培養(yǎng)皿。


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