細胞培養(yǎng)，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細胞培養(yǎng)中常常會遇到很多的細節(jié)問題，而每個問題都有可能導(dǎo)致細胞培養(yǎng)的失敗。所以做好細胞的污染防治是能否順利開展細胞實驗的必要措施。

1.細菌污染

細菌污染是細胞培養(yǎng)中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

左邊的就是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會延軸向快速游動，量少時培養(yǎng)基澄清。右圖是顆粒狀污染，一般培養(yǎng)基會渾濁或有白色沙狀沉淀。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁；厭氧菌在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長時間才會觀察到渾濁現(xiàn)象。

污染處理：由于國內(nèi)細胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周，效果相對還不錯。

2. 真菌污染

細胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素B/T25瓶，處理一周。

注：兩性霉素毒性較大，需要在細胞有50%以上且狀態(tài)沒受大影響前處理。

3.支原體污染

支原體的危害：支原體污染可以改變細胞的特性。例如部分支原體會快速消耗培養(yǎng)液中的精氨酸，與細胞競爭營養(yǎng)，從而使細胞的生長速度減慢或停止；同時支原體還可以改變細胞的酶譜、細胞膜成分，造成細胞染色體異常或細胞病理性改變等。上述情況會嚴重影響到使用這些細胞所做實驗的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論不可靠。

（PCR法檢測細胞上清中的支原體污染）

支原體的預(yù)防與清除：由于支原體無法在鏡下直接看到，需要通過PCR法等進行檢測才發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)污染后比較難發(fā)現(xiàn)。建議在養(yǎng)細胞每月檢測一次并結(jié)合每周抽檢，做到有污染早發(fā)現(xiàn)。對于正在進行支原體去除處理的細胞建議每周必檢，直至出現(xiàn)陰性結(jié)果并至少維持一月。不同的細胞分開處理，優(yōu)先處理“支原體陰性"細胞，后處理正在做去除處理的和受感染的細胞。同時，新引進的細胞系都進行支原體檢測，確保不給實驗室?guī)硇碌奈廴尽?/p>

4.實驗室細胞污染防治

建立良好的規(guī)章制度對減少細胞污染會有很大的幫助。包括準入制度、操作規(guī)范和日常管理制度。

準入制度：包括了人員的和物料的。人員需要進行培訓之后才能自己進行操作，而且要符合穿戴要求才能進實驗室，如白大褂、隔離服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品應(yīng)嚴格消毒滅菌，而購買的物品需要從正規(guī)的、可靠的渠道購買。新買的細胞應(yīng)檢測驗證后再使用。

操作規(guī)范：對于常規(guī)操作最好制定規(guī)范，且實驗室人員都要按操作規(guī)范進行，不能隨意更改，同時也是培養(yǎng)實驗人員的良好操作習慣。比如，槍頭滴管吸完就不再二次伸入培養(yǎng)基中吸取，一次吸夠足夠量的培養(yǎng)基。加液時也應(yīng)盡量做到懸空加液，這些都可有效預(yù)防支原體污染和細胞交叉污染。另外可以的話，一次只操作一株細胞，細胞與細胞間最好有一點時間間隔，避免交叉污染。

日常管理制度：則包括環(huán)境及耗材試劑等的使用、清潔、保養(yǎng)等各方面的規(guī)則、方法。還有試劑耗材等的用量、庫存及采購等的管理，包括細胞樣品的兩級庫存管理。對于不易發(fā)現(xiàn)的污染源，最好定期進行檢測，主要是支原體污染和細胞交叉污染。

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