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          部分分解多肽兩端有關(guān)的 PCR 法篩選 PK-120 基因?qū)嶒?/h1>
          發(fā)布時間: 2022-03-24  點擊次數(shù): 1008次

          材料與儀器


          PK-120
          Sephadex-50 Gene Amp RNA PCR 試劑盒 合成寡聚核苷酸 抽提液 酵母 tRNA
          PCR 擴(kuò)增儀


          步驟


          實驗所需「試劑」具體見「其他」


          1. 引物設(shè)計


          PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中,最長序列 K-15,16 為引物設(shè)計的依據(jù):

          1.1 考慮全部編碼的組合,

          1.2 考慮人編碼的使用頻率,設(shè)計 PCR 引物,正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的 PCR 產(chǎn)物當(dāng)中,50 bp 的產(chǎn)物為目的 cDNA。


          2. PCR 擴(kuò)增


          從肝臟來源的 poly(A)+ RNA 中,用 Gene Amp RNA PCR 試劑盒如以下所述,合成 cDNA 0.1ug 的 poly(A)+ RNA 中,加入 5 mmol/L MgCl2:

          1×PCR 緩沖液Ⅱ,

          2 mmol/L dNTPs,

          1u 的 RNase inhibitor,

          2.5 umol/L random hexamers

          2.5 u 反轉(zhuǎn)錄酶,

          混勻,總體積為 20 ul。


          在 PCR 擴(kuò)增儀上反應(yīng),PCR 參數(shù)為 :

          25℃ 10 min,

          42℃ 30 min,

          99℃ 5 min,

          25℃ 5 min ,

          第 1 循環(huán)反應(yīng),合成 cDNA。

          在反應(yīng)液中再分別加終濃度為 2 mol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液Ⅱ,加 1nmol 3' 引物 5' 引物。混合,總體積為 100 ul。

          94℃ 3 min 1 循環(huán)。

          94℃ 1 min,

          37℃~42℃,2 min,

          72℃, 2 min,

          40 循環(huán)。

          72℃, 7 min,1 循環(huán)。


          3. 凝膠電泳及提取 DNA


          純化 PCR 產(chǎn)物后,在 0.25×TBE 溶液中,進(jìn)行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳,分子量標(biāo)準(zhǔn)使用限制性酶 Msp1 消化的質(zhì)粒 pBR322。電泳結(jié)束后,凝膠經(jīng)溴化乙錠染色,紫外照射,觀察到 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物。將這 50 bp 的條帶切下,在抽提液中,室溫放置過夜之后 1200 r/min 4℃ 離心 10 min,回收上清。反復(fù)操作兩次,用乙醇沉淀 2 次,用 TE 液溶解,上樣 Sephadex-50 柱,再用乙醇沉淀洗脫組分,沉淀懸浮于 TE 溶液中。


          4. 測定堿基序列


          抽取提出的 PCR 產(chǎn)物用 PCRⅡ載體亞克隆,測定堿基序列。其結(jié)果以肝臟 poly mRNA 為模板,據(jù)引物 S15-i 和 A15-i 擴(kuò)增的 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物序列,和從氨基酸序列預(yù)測的堿基序列*一致。表明這是編碼母的部分分解多肽的 cDNA。


          注意事項


          常見問題


          試劑:


          Sephadex-50


          Gene Amp RNA PCR 試劑盒


          合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS,INC 公司產(chǎn)品合成寡聚核苷酸


          抽提液


          750 mmol/L 醋酸銨-10 mmol/L 醋酸鎂-0.1 mmol/L EDTA-0.1%SDS-1%TE 飽和酚


          25ug/ml 酵母 tRNA


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