小鼠胚胎MEF細(xì)胞的提取步驟：

1.將新鮮收獲的胚胎放入10厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中

2.用PBSA覆蓋胚胎，取出胎盤和其他母體組織

3.切掉頭頂（眼睛及以上），取出內(nèi)臟

4.保存頭部/卵黃囊進(jìn)行DNA分離以進(jìn)行基因分型檢測(cè)

5.將胚胎體置于單獨(dú)的10厘米板中

6.加入1mL胰蛋白酶，用刀片切碎成1mm的小碎片

7.用酒精燈火焰對(duì)樣品之間的刀片進(jìn)行消毒

8.將皿置于37°C培養(yǎng)箱中30-45分鐘（傾斜，使胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞）

9.通過在每口井中添加4mL MEF培養(yǎng)基（通常DMEM+10%FBS+1%G/A）來抑制typsin活性。

10.用移液管10-20x吹打分離組織

11將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到T75燒瓶或10cm平板上，并添加6-15mL MEF培養(yǎng)基

12.讓細(xì)胞生長融合（3-4天）

13.抽出培養(yǎng)基，用10mL PBS沖洗

14.加入3mL胰蛋白酶，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10min

15.加入7mL MEF培養(yǎng)基進(jìn)行中和

16.用移液管吸至離心管離心，使細(xì)胞重新懸浮

17.將懸浮液轉(zhuǎn)移到2個(gè)T175燒瓶中，并向每個(gè)培養(yǎng)瓶中添加50mL MEF培養(yǎng)基

18.讓細(xì)胞生長融合（3-4天）

19通過胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，冷凍細(xì)胞@3x106細(xì)胞/瓶，注意冷凍不能密度太稀，此細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的存活會(huì)大量減少。

備注：1.在細(xì)胞培養(yǎng)房中執(zhí)行細(xì)胞分離，并注意無菌操作，

2. 建議使用含有血清的凍存液凍存。

3. 原代分離培養(yǎng)請(qǐng)使用慶大霉素/兩性霉素溶液來防止細(xì)胞污染發(fā)生。

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