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          CHO-K1倉鼠卵巢細胞株的培養(yǎng)方法

          發(fā)布時間: 2024-04-10  點擊次數(shù): 645次

          中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞是第一個被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認可的用于生物制藥領域的生產(chǎn)細胞,已廣泛應用于各種治療性蛋白質藥物的大規(guī)模制備,包括重組抗體、重組單體蛋白質以及重組融合蛋白質等。CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細胞。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養(yǎng),并需要添加血清,由于血清的批間穩(wěn)定性問題,及后來病毒安全性問題,無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢。實驗室常以貼壁的CHO K1細胞構建穩(wěn)轉細胞株。

           

                                          圖片


          細胞形態(tài):長梭形(10×倍鏡)
          培養(yǎng)條件:DMEM/F12培養(yǎng)基,胎牛血清終濃度為10%
          培養(yǎng)溫度:37°C

          細胞復蘇:


          1.在攝氏37度的水浴中輕輕攪動,為防止受到污染,不要把O形環(huán)和蓋子放在外面。解凍應迅速(約2分鐘)。
          2.解凍后把凍存管盡快從水中拿出來,用75% 乙醇浸泡或噴灑消毒乙醇。從現(xiàn)在開始所有的操作都應該進行在嚴格的無菌條件下進行。
          3.將細胞懸液轉移到含有9 ml(血清)細胞培養(yǎng)基的離心管中,10000 rpm離心5分鐘。
          4.棄上清,用(血清)細胞培養(yǎng)基重懸細胞,轉移至T25細胞培養(yǎng)瓶中。
          注意:在T25瓶加入細胞之前,可以先將包含(血清)細胞培養(yǎng)基的容器放入培養(yǎng)箱內至少15分鐘,以便培養(yǎng)基達到正常PH(7.0至7.6)。
          5.將培養(yǎng)瓶轉移至37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。


          細胞傳代:


          1.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,以消除所有痕量的血清
          2.加入2.0 ~ 3.0 mL  0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。
          注意:為了避免結塊,請不要通過擊打或搖晃瓶子。可在37℃培養(yǎng)箱等待細胞,加快細胞分散的速度。
          3.加入6 - 8 mL的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化并反復吹打,轉移至離心管,1000 rpm 5 min。
          注意:(血清)細胞培養(yǎng)基里有血清,血清里過量的血清蛋白與胰酶結合,競爭性抑制,使胰酶無法繼續(xù)消化細胞。
          4.  棄上清,添加新的培養(yǎng)基重懸細胞,向培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中添加適當?shù)募毎麘腋∫海⒀a充新鮮(血清)細胞培養(yǎng)基。
          5. 將培養(yǎng)瓶轉移至37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
          注意:ATCC建議傳代比例為:1:4至1:8。


          細胞凍存:


          1.當細胞處于對數(shù)生長期時,可進行細胞凍存。
          注意:常見的細胞凍存密度是1-10*10^6 cells/mL。
          2.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,以消除所有痕量的血清和細胞生長過程中產(chǎn)生的廢料。
          3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。
          4.加入適量的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化,槍頭反復吹打混勻后將細胞懸液轉移至離心管,1000 rpm 5 min。
          5.棄上清,依次加入700 μL培養(yǎng)基,200 μL胎牛血清重懸細胞,最后添加 10% DMSO 后梯度降溫凍存。

          注意:DMSO加到細胞里會迅速放熱,對細胞活力造成損傷,因此可以選擇在最后一步添加,加完迅速轉移至低溫。

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